Одинокий

Научные отчеты, том 13, Номер статьи: 10093 (2023) Цитировать эту статью

584 доступа

1 Альтметрика

Подробности о метриках

Определяющая биология, которая отличает нейтрофильные внеклеточные ловушки (NET) от других форм гибели клеток, остается нерешенной, а методы, которые однозначно идентифицируют NET, остаются неуловимыми. Измерение комбинационного рассеяния света дает целостное представление о молекулярном составе клеток на основе характерных колебаний связей в таких компонентах, как липиды и белки. Мы собрали спектры комбинационного рассеяния света из NET и замороженных/оттаивающих некротических клеток, используя специально созданную высокопроизводительную платформу, которая способна быстро измерять спектры отдельных клеток. Анализ главных компонентов спектров комбинационного рассеяния света из NET четко отличает их от некротических клеток, несмотря на их сходную морфологию, демонстрируя их фундаментальные молекулярные различия. Напротив, классические методы, используемые для анализа NET, иммунофлуоресцентной микроскопии, внеклеточной ДНК и ELISA, не могли дифференцировать эти клетки. Кроме того, анализ спектров комбинационного рассеяния с помощью машинного обучения выявил тонкие различия в NET, индуцированных липополисахаридом (LPS), в отличие от NET, индуцированных форболмиристатацетатом (PMA), демонстрируя, что молекулярный состав NET варьируется в зависимости от используемого стимулятора. Это исследование демонстрирует преимущества рамановской микроскопии в различении NET от других типов гибели клеток и по пути их индукции.

Внеклеточные ловушки нейтрофилов (NET) представляют собой форму гибели клеток, характеризующуюся разрушением ядра и высвобождением ДНК в виде облака или струноподобной структуры1,2. Из-за их деликатного и разнообразного характера разработка конкретных и простых методов характеристики сетей была затруднена3,4. Хотя большое количество исследований продемонстрировало, что образование NET является контролируемой и отдельной формой гибели клеток2,5, существует значительное совпадение с другими путями гибели клеток, и точное определение NETs находится в стадии обсуждения4. Деконденсация и высвобождение ДНК отличает NET от таких процессов, как апоптоз, некроптоз и пироптоз, каждый из которых приводит к ядерной конденсации6,7. Однако более поздние стадии многих путей гибели клеток могут привести к разрушению ядра и высвобождению ДНК, что потенциально затрудняет анализ конечных точек. Например, вторичный некроз, возникающий после апоптоза, приводит к деконденсации ДНК, лизису клеток и высвобождению внеклеточного содержимого8,9,10. Кроме того, нерегулируемая гибель клеток, такая как некроз, вызванный непосредственно физиологическим повреждением клеток, может привести к появлению признаков, очень похожих на образование СЭО11,12. Крайне важно различать эти типы гибели клеток, чтобы понять, какие пути активируются, вызывая гибель клеток, как ими можно управлять, чтобы смягчить потенциальные патологические последствия, и является ли смерть клеток результатом физиологических повреждений или стресса для клеток во время процесса. экспериментальные процедуры или является настоящим путем запрограммированной гибели клеток6.

Обнаружение и количественная оценка NET обычно основывается на сочетании измерений внеклеточной ДНК, морфологии клеток и белковых маркеров, наиболее распространенными из которых являются миелопероксидаза (MPO), нейтрофильная эластаза (NE) и цитруллинированные гистоны. Для измерения внеклеточной ДНК используются флуоресцентные красители, такие как PicoGreen2, для измерения ДНК, высвободившейся в супернатант. Непроницаемые красители ДНК, такие как Sytox Green, также часто используются для окрашивания сетей, исключая при этом клетки с неповрежденной мембраной, что позволяет проводить количественную оценку с помощью таких методов, как проточная цитометрия13,14,15. Несмотря на простоту реализации, эти методы ограничены из-за их неспособности отличить NET от других форм гибели клеток. Морфологический анализ улучшает эту задачу, но требует визуализации с последующим ручным подсчетом или автоматической обработкой изображений16,17,18,19,20. Это может быть трудоемким и привести к систематической ошибке, поэтому для повышения точности часто вводятся белковые маркеры. Помимо вспомогательных методов визуализации, белковые маркеры используются в сэндвич-ИФА, в которых NET иммобилизуются с помощью белковых антител, обычно анти-МПО, и обнаруживаются с помощью антител к ДНК (или наоборот)21,22,23.